摘要:利用形态学分类法和AFLP分子标记技术对45份菠菜(Spinacia oleracea L.)育种材料的遗传多样性和亲缘关系进行了研究?结果表明,从256对引物中筛选出18对扩增效果较好的引物,共扩增到960个条带,146个多态性位点,PIC值(平均多态信息量)为15.2%?AFLP标记技术的聚类分析表明,第一类群主要以欧美资源和有欧美血统的杂交种为主;第二类群主要以日本资源和含有日本血统的杂交种为主;第三类群以中国本土品种为主?从聚类结果看,与形态学的分类结果基本一致,而且聚类结果与地域来源和形态特征有一定的对应关系?

　　关键词:菠菜(Spinacia oleracea L.); AFLP; 遗传多样性;亲缘关系;形态学

　　中图分类号:S636.1;Q7文献标识码:A文章编号:0439-8114(2014)11-2561-06

　　基金项目:国家科技支撑计划课题项目(2012BAD02B04;2012BAK26B03);北京市农林科学院科技创新能力建设专项(KJCX201202001;KJCX201101010);北京市农林科学院青年科研基金项目(QNJJ201211);北京市科委重大课题项目(D131100000413001)

　　菠菜(Spinacia oleracea L.)是藜科(Chenopodiaceae)菠菜属(Spinacia)中的一个栽培种?原产于伊朗,以叶片和嫩茎为食用器官,适应性广?耐储藏?供应期长?栽培方式多样,在世界各地普遍种植,是我国主要的出口蔬菜之一?但是目前我国市场上菠菜品种混杂,研究仍相对薄弱,优良品种材料较难获得已经成为菠菜育种的严重障碍?

　　关于菠菜遗传多样性及亲缘关系的研究,近年来有一些报道,采用的方法有核型分析[1]?同工酶技术[2]?RAPD技术[3]?而使用AFLP(Amplified fragment length polymorphism)分子标记方法对菠菜进行遗传多样性和亲缘关系的研究尚未见报道?AFLP技术于1993年由荷兰科学家Zabeau和Vos创建[4],是结合了RFLP和PCR的一种技术,兼具RFLP的稳定性和PCR的高效性,目前已被广泛应用在物种的遗传多样性分析[5]?种质资源鉴定[6]等方面?本试验结合形态学性状分析和AFLP技术对45份菠菜材料进行了遗传多样性分析,为菠菜的种质资源收集?保存及利用提供一定的理论依据?

　　1材料与方法

　　1.1试验材料

　　45份菠菜材料均由北京市农林科学院蔬菜研究中心菠菜育种课题组提供,2010年4月采集于北京市农林科学院蔬菜研究中心四季青实验农场?试验材料名称及其来源见表1?

　　1.2试验方法

　　1.2.1菠菜种质资源形态学调查在春?秋两季于田间采集45份菠菜样品,每个样品3次重复,调查菠菜田间质量性状,包括:株型?叶片挺直度?叶型?叶尖?叶基?叶面褶皱?叶面光泽?叶色?叶裂刻?叶柄色?抽薹期及叶厚?对试验数据进行统计换算,利用SPSS 11.0 软件计算不同种群间的遗传相似度,绘制出聚类分析树状图?

　　1.2.2AFLP分析参照CTAB法[7]并进行改良提取菠菜的基因组DNA?基因组DNA的酶切?连接?预扩增和选择性扩增参考文献[8]进行了体系优化?

　　利用稀有切点限制性内切酶(6个识别位点的PstⅠ)与多切点限制性内切酶(4个识别位点的MseⅠ)相搭配进行双酶切?由于菠菜遗传背景相对较宽,所以采用了P+3/M+3选择性引物组合,引物名称及序列见表2?

　　PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后利用强碱法[将凝胶放入第一个水槽中2~3 min漂洗7~8次,然后转到0.1%硝酸银溶液中静置染色10 min;在第二个槽中漂洗7~8次,置于1.5%氢氧化钠溶液中(含1%甲醛),显影3~5 min;再放入第一个水槽中2~3 min后漂洗7~8次]进行染色,读胶并记录?对多态性条带进行整理并经NTSYS 2.10e?Structure 2.3软件分析,建立聚类分析树状图?

　　2结果与分析

　　2.1菠菜种质资源田间性状聚类分析

　　对45份菠菜种质的形态学标记进行聚类分析,利用SPSS 11.0软件计算出不同种群间的遗传相似度,对数据进行聚类分析,构建聚类分析树状图(图1)?如图1所示,形态学标记聚类将供试的45份菠菜种质分为3个类群?

　　第一类群:美2号?美2号×全能?美3号?“06-118”?丹麦1号?美2号ד98-58”?法国5号?美2号×联?p07-22?“07-75”?强力398?荷兰5号?“98-58”×laron?冠军强力?全能×哈?美2号×罗?金成尖?法国6号×全能?福将?该类群的品种生物学特征为半直立株型,卵形叶型,叶面微皱,叶片有光泽且颜色为深绿色,叶面较厚,抽薹较晚?

　　第二类群:???ぅ??????07-p50?07-p24早熟?“07-74”?全能?“9508”×尖?沈尖叶?07-p24?07-p69?金成×哈?美2号ד9858”?07-p49???ぅ?×前卫433?07-65?07-75??????“9507”×全能?全能ד9780”?p5?此类群的主要特征是株型为半直立,叶型为椭圆形,叶面微皱,叶色为绿色,抽薹期适中?

　　第三类群:西安大叶?虎耳菜?p40-1?“07-86”?大叶?哈×全能?此类群的主要特征是株型为半直立,叶面微皱,叶色为绿色,叶裂刻浅,叶片厚度较薄?

　　利用形态学标记方法对45份菠菜育种材料进行分类,从地理分布来看,基本上可以把不同地理分布的菠菜材料分开,以欧美品种和含有欧美血统的杂交种的材料聚为同一类群,以日本品种和含有日本血统的杂交种聚为同一类群,以中国品种和含有中国血统的杂交种聚为一个类群?

　　2.2菠菜种质田间形状的相关性分析

　　利用SPSS 11.0软件对45份菠菜育种材料的12个田间性状进行相关性分析?结果表明,有4组田间性状呈极显著负相关,株型和叶型(相似系数-0.351)?株型和叶面褶皱(-0.518)?叶面挺直度和叶尖(-0.384)?叶尖和株型(-0.494)?其中负相关性最大的是株型和叶面褶皱(-0.518),即株型越开展,叶面的褶皱越多;有6组田间性状呈极显著正相关,叶型和叶尖(0.636)?叶型和叶面光泽(0.469)?叶面褶皱和叶尖(0.542)?叶尖和叶厚(0.413)?叶面褶皱和叶厚(0.493)?叶色和抽薹期(0.413)?其中正相关性最大的是叶型和叶尖(0.636),说明叶尖很大程度上决定了叶片形状,研究比较了各种质量性状之间的关联性,为下一步研究其控制机理提供依据?

　　利用SPSS 11.0软件分析了菠菜种质田间性状之间的关联程度,并绘制成聚类图?由图2可知,菠菜的许多田间性状关联性很强,鉴于这些性状,分别针对每对相关性很高的性状设计完整的试验,进一步证实其相关的可靠性,从分子水平上进行QTL定位,验证其性状的位点与田间相关性试验结果的一致性?

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