摘要：以80%乙醇为提取溶剂，以树头菜黄酮提取率为指标，在单因素试验基础上，用响应面法优化野生树头菜黄酮的提取条件，并测定其体外抗氧化活性。结果表明，最佳提取工艺为提取温度65 ℃、提取时间1.3 h、液料比28∶1（mL∶g）、提取2次，树头菜黄酮提取率为0.497%。树头菜黄酮具有较强的清除超氧阴离子自由基、羟自由基的能力和还原能力，清除超氧阴离子自由基和羟自由基的IC50分别为0.615、0.415 mg/mL，其抗氧化能力高于抗坏血酸（VC）和叔丁基对苯二酚（TBHQ）。

　　关键词：树头菜；响应面法；黄酮；抗氧化活性

　　中图分类号：S647；Q819 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）13-3145-04

　　树头菜是一种营养丰富、口味独特的野生蔬菜。树头菜是山柑科鱼木属的一种乔木，主要分布于海拔1 500 m以下的热带、亚热带地区[1，2]，生长于平地或山谷林地等，多为野生[3]。它不仅可作为行道绿化树种，还兼具药食价值，其根、茎、叶均可入药，味苦性寒。根具有清热解毒、舒筋活络的功效，可治疗肝炎、痢疾等疾病；叶具有健胃的功效；可解毒，治烂疮[4-7]。树头菜含有氨基酸、维生素、矿物质、黄酮、糖类等多种生物活性成分[8-10]。目前，对树头菜的研究主要以化学成分及分析方法为主。黄酮是一种天然的生物活性物质，具有药理作用和保健功能[11-14]。本试验利用响应面法对树头菜黄酮的提取工艺条件进行优化，研究树头菜黄酮的抗氧化作用，旨在为深入研究树头菜的药理、保健作用和进一步开发利用资源提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂

　　树头菜嫩茎叶采自连云港市云龙涧风景区，淮海工学院化学工程学院制药教研室鉴定为山柑科鱼木属植物树头菜。将树头菜洗净，在60 ℃下于电热恒温鼓风干燥箱中烘干，粉碎，过60目筛。

　　芦丁标准品（中国药品生物制品鉴定所）；抗坏血酸、叔丁基对苯二酚、邻苯三酚、水杨酸、硫代巴比妥酸、三羟基氨基甲烷、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、硫酸亚铁、乙醇、石油醚、丙酮、氯仿等其他试剂均为分析纯（上海国药集团试剂公司）。

　　1.2 仪器与设备

　　UV-2550型紫外分光光度计（日本岛津公司）；RE-5285A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；TDL-4型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

　　1.3 试验方法

　　1.3.1 树头菜黄酮提取工艺 树头菜干粉→80%乙醇水溶液提取→离心→滤液→减压浓缩→提取液定容→测定总黄酮含量。

　　1.3.2 树头菜黄酮提取率的测定 按文献[15]中的方法测定树头菜黄酮的含量。标准曲线回归方程为A=-0.001 7+0.026 1C，R2=0.999 4。

　　1.3.3 单因素试验 分别考察乙醇溶液体积分数（50%、60%、70%、80%、90%）、液料比（20∶1、25∶1、 30∶1、35∶1、40∶1，mL/g，下同）、提取温度（50、60、70、80 ℃）、提取时间（1.0、1.5、2.0、2.5 h）和颗粒尺寸（20、40、60、80目）对树头菜黄酮提取率的影响。

　　1.3.4 响应面优化试验 在单因素试验的基础上，选取液料比、提取温度、提取时间为自变量，树头菜黄酮提取率为响应值进行响应面优化组合。试验因素和水平见表1，数据采用Design Expert 8.05 统计软件进行分析。

　　1.3.5 树头菜黄酮的抗氧化活性测定 参照文献[16]中的方法测定树头菜黄酮的抗氧化活性。

　　2 结果与分析

　　2.1 单因素试验结果

　　不同单因素对树头菜黄酮提取率的影响结果见图1至图5。由图1至图5可见，选择最适宜的条件水平，乙醇溶液体积分数80%，提取时间1.5 h、液料比25∶1、颗粒尺寸60目、提取温度60 ℃为宜。2.2 响应面优化试验结果

　　响应面试验优化树头菜黄酮提取条件的结果见表2。用Design Expert 8.05软件对表2数据进行分析，得到树头菜黄酮提取率对提取时间、提取温度、液料比的回归方程：黄酮提取率（Y）=0.497 4-0.005 9A+0.013 6B+0.004 0C+0.005 8AB-0.001 5AC+0.042 0BC-0.005 6A2-0.041 1B2-0.018 8C2。

　　由表3回归模型方差分析结果可知，模型项P值小于0.000 1，表明响应回归模型达到了极显著水平，失拟项P值0.110 2>0.05，说明该模型可信度高。模型的相关系数R为0.996 0，修正相关系数RAdj为0.990 9，表明树头菜黄酮提取率的试验值和预测值拟合度较高。回归方程各项的方差分析表明，除方程交互项AC外，其他项对黄酮提取率的影响均达显著水平。选定的因素对黄酮提取率影响的顺序为提取温度、提取时间、液料比。

　　由图6可以看出，各因素交互作用对响应值的影响，当固定液料比为25∶1时，提取时间和温度的交互作用显著；当固定提取温度为60 ℃时，提取时间和液料比的交互作用不显著；当固定提取时间1.5 h时，提取温度和液料比的交互作用显著。因此，在本试验的范围内可以通过适当提高提取温度和液料比来提高黄酮的提取率。

　　根据所得试验模型，预测树头菜黄酮提取的最优工艺条件为提取时间1.31 h，提取温度64.69 ℃，液料比28.22∶1，在此条件下黄酮的提取率可达到0.503%。考虑实际情况，将最佳工艺条件修正为提取时间1.3 h、提取温度65 ℃，液料比28∶1。在修正条件下，实际提取率为0.497%，与理论值接近，说明该模型可用于优化筛选树头菜黄酮的提取工艺。

　　2.3 体外抗氧化试验结果

　　图7至图9为树头菜黄酮的还原能力、羟自由基清除能力和超氧阴离子自由基清除能力结果。由图7至图9可见，在各物质质量浓度范围内，清除率与质量浓度均呈线性关系。由图8可知，在质量浓度小于0.2 mg/mL时，对羟基自由基的清除能力的大小顺序为叔丁基对苯二酚（TBHQ）>树头菜黄酮>维生素C；质量浓度大于0.2 mg/mL后，树头菜黄酮对羟基自由基的清除能力大于维生素C和TBHQ。其IC50分别为树头菜黄酮0.415 mg/mL，维生素C 0.624 mg/mL，TBHQ 0.733 mg/mL。

　　由图9可知，在质量浓度小于0.3 mg/mL时，树头菜黄酮对超氧阴离子自由基的清除能力低于TBHQ和维生素C；质量浓度大于0.3 mg/mL时，树头菜黄酮对超氧阴离子自由基的清除能力大于维生素C和TBHQ。树头菜黄酮的IC50为0.615 mg/mL，维生素C的IC50为0.858 mg/mL，TBHQ的IC50为0.929 mg/mL。由此可知，树头菜的还原能力、羟自由基清除能力和超氧阴离子自由基清除能力均高于同质量浓度的维生素C和TBHQ。

　　3 小结

　　利用响应面法优化树头菜黄酮的提取率，得到的最佳提取工艺修正条件为提取温度65 ℃、提取时间1.3 h、液料比28∶1，树头菜黄酮提取率为0.497%。与预测值相比误差较小，该模型用于优化树头菜黄酮的提取工艺准确有效。

　　树头菜黄酮的抗氧化能力在试验范围内与质量浓度的关系显著。与同质量论文答辩浓度维生素C和TBHQ相比，树头菜黄酮的还原能力、羟自由基清除能力和超氧阴离子自由基清除能力均高于维生素C和TBHQ，是一种有效的自由基清除剂，可作为天然抗氧化剂用于食品工业或医药领域。

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