摘要：为了探明罗田板栗新品系玫瑰红耐贮藏的内在原因，评价其栗实中的内生细菌资源，用组织分离培养法从栗实中分离其内生细菌，并通过比对结构、生理生化特征及16S rDNA序列分析等方法对所分离的内生细菌进行鉴定。结果从玫瑰红板栗栗实中分离得到2株内生细菌FR1和FR2，经鉴定为水生拉恩菌（Rahnella aquatilis）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。

　　关键词：罗田板栗；玫瑰红；内生细菌；分离鉴定；16S rDNA

　　板栗（Castanea mollissima Blume）俗称栗子，营养丰富，风味较佳，是重要的干果品种，中国板栗的栽培面积和总产量均居世界首位。板栗对山区经济发展和出口创汇具有重要意义。但由于其含水量高的特点，贮藏期易发生栗实腐烂，腐烂率甚至可高达50%，严重制约了板栗产业的发展[1]。栗实腐烂的发生机理及绿色防治逐渐成为研究热点[2-5]。

　　内生菌（Endophyte）是指在生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部，且被感染的宿主植物（至少是暂时）不表现出外在病症的真菌或细菌[6]。这些内生菌对宿主植物的生长发育、抗逆性、抗虫性及抗病性方面均有重要作用，在农业生产、化工制药、卫生保健等方面有巨大的潜力[6，7]。研究者已在棉花、玉米、甜菜、烟草和黄瓜等多种作物体内分离筛选到具有防病或诱导抗病的内生真菌和细菌[6-10]，但关于板栗栗实内生细菌资源的研究鲜见报道。试验以新培育的耐贮藏南方板栗——罗田板栗新品系玫瑰红栗实为研究对象，采用组织分离法分离，并利用16S rDNA序列分析和形态、生理生化相结合的方法鉴定其内生细菌，以期为筛选抗栗实腐烂的拮抗细菌及开发生防保鲜剂奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 板栗果实 板栗品系为玫瑰红，采摘于湖北省罗田县胜利镇，去苞壳后得到栗实。

　　1.1.2 培养基 LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂20 g，水1 000 mL，pH 7.2。

　　1.1.3 主要试剂 克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司；2×Taq mix、TaqDNA聚合酶、dNTP、DNA Marker DL2000购自宝生物工程（大连）有限公司，大肠杆菌TOP10菌株为经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室保存；细菌16S rDNA通用引物27F： 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′、 1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′由上海生工生物工程有限公司合成。其他试剂均为国产分析纯。

　　1.2 试验方法

　　1.2.1 栗实处理 将栗实在自来水下流水冲洗后，用75%的乙醇浸泡3 min，再用8%次氯酸钠浸泡10 min，无菌水清洗5～7次，用无菌吸水纸吸干水分。取清洗最后一遍的无菌水0.2 mL涂布于LB培养基上，37 ℃培养3 d，据此验证所用消毒方法是否能杀死供试材料表面全部细菌[11]。

　　1.2.2 内生细菌分离纯化 在无菌环境中，用无菌小刀将处理好的栗实切开并去壳，在种仁中心区和边缘区处切取边长为2～5 mm的正方体组织块，置于经消毒灭菌的研钵中，加无菌水适量，研磨，静置15 min，取研磨后的上清液稀释成500倍和1 000倍的组织稀释液，取200 μL涂布于LB培养基上，于37 ℃倒置恒温培养1～2 d，从LB平板上将具有不同菌落形态特征的内生细菌单菌落挑出，划线纯化培养，获得的细菌单株进行编号、转管，4 ℃冰箱保存。

　　1.2.3 内生细菌初步鉴定 将分离的内生细菌适当稀释后接种到LB培养基上，置于36 ℃的温箱内培养1～2 d，观察菌株形态和培养性状，进行革兰氏染色和生理生化试验，对照文献[12]和文献[13]进行初步鉴定。

　　1.2.4 内生细菌分子学鉴定 将分离纯化的板栗内生细菌进行活化，挑取少量菌体以细菌16S rDNA通用引物27F、1 492R进行菌落PCR扩增，PCR扩增反应体系50 μL，18 μL无菌ddH2O，25 μL 2×Taq mix，1.5 μL Primer1，1.5 μL Primer2，4 μL悬浮菌液；PCR流程：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，35次循环；延伸补齐72 ℃ 10 min。扩增产物经过纯化后连接到克隆载体pMD18-T上，转化感受态大肠杆菌TOP10（CaCl2法制备感受态细胞），然后将转化的大肠杆菌TOP10涂布在加有100 μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂固体培养基上，37 ℃恒温培养12～18 h；从上述LB平板上随机挑取5个白色菌落，转移到含有氨苄青霉素的LB培养基上，37 ℃过夜，将通过PCR重组子验证的菌落送交上海生工生物工程有限公司双向测序，测序结果进行BLAST比对（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST），选取同源性高的16S rDNA序列作为参比对象，使用ClustalX进行DNA序列的排序，采用MEGA 5.1软件中的邻接法（Neighbour-Joining method）构建系统发育树，并进行1 000次的自展检验（Bootstrap），将ME树上与之最接近的种类确定为内生菌可能的种类。

　　2 结果与分析

　　2.1 栗实内生细菌初步鉴定情况

　　从罗田板栗玫瑰红栗实中共分离出2株内生细菌，分别编号为FR1和FR2。其中，细菌FR1菌落圆形、边缘齐整、表面湿润，菌落不透明，呈灰白色，菌体杆状，革兰氏染色为阴性（图1A）；能产生精氨酸水解酶（图1B）；甲基红反应为阳性（图1C）；氧化酶试验阳性（图1D）；不具有明胶酶，不能水解明胶（图1E）；能分解葡萄糖，乙酰甲基甲醇反应为阳性，产生红色化合物（图1F）；可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，出现绯红色阳性反应（图1G），但没有氮气放出；能产生苯丙氨酸脱氨酶，加入三氯化铁试剂后产生绿色化合物（图1H），初步鉴定FR1为拉恩氏菌属（Rahnella sp.）。

　　内生细菌FR2菌落扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，菌落直径2～3 mm，菌体呈杆状、单生，革兰氏阳性菌（图2A），产生游离椭圆形芽孢（图2B），初步鉴定FR2为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。

　　2.2 栗实内生细菌16S rDNA序列分析结果

　　利用16S rDNA通用引物27F和1 492R从分离得到的2株内生细菌的基因组中扩增出的DNA片段长度为1 000～2 000 bp（图3），扩增出的PCR产物经纯化进行DNA测序，结果表明FR1、FR2的序列长度分别为1 400、1 038 bp。序列提交GenBank数据库进行BLAST比对，将FR1、FR2菌株的16S rDNA序列与GenBank中的序列进行比较发现，与FR1同源性最高的菌为拉恩氏菌属，与FR2同源性最高的是芽孢杆菌属。将FR1、FR2序列与数据库中同源性较高的几个菌株进行比较，并用ClustalX进行多序列比对、用MEGA 5.1软件中的邻接法构建系统的进化树（图4）。结果表明FR1的16S rDNA序列与细菌Rahnella aquatilis KC351183.1的序列同源性高达97%，从系统发育树可以看出，FR1与Rahnella aquatilis KC351183.1聚为一簇，该结果支持初步鉴定的结果。综合FR1的形态、生理生化特征和16S rDNA的序列分析结果，将FR1鉴定为水生拉恩菌（Rahnella aquatilis）；从系统发育树可以看出FR2与Bacillus licheniformis EU221362.1聚为一分支，FR2的16S rDNA序列与Bacillus licheniformis EU221362.1的序列同源性高达98%，该结果支持初步鉴定结果，综合FR2的形态、生理生化特征和16S rDNA的序列分析结果，将FR2鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。

　　3 小结与讨论

　　板栗储藏过程中发生腐烂是一个复杂的过程，其中，致病菌的侵染是其主要原因。本研究从罗田板栗玫瑰红中分离到2株菌株，通过生理生化特征初步鉴定为拉恩氏菌属（Rahnella sp.）和芽孢杆菌属（Bacillus sp.），结合其16S rDNA的序列分析结果，将2株菌株分别鉴定为水生拉恩菌（Rahnella aquatilis）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。

　　有资料显示，拉恩氏菌属属于肠杆菌科，广泛分布于水、土壤、植物根际及蜗牛体内，偶尔能在食品、种子和临床微生物样本（伤口、肠胃病患者粪便、败血症患者体内）中发现；但目前尚未能明确其致病性。有研究认为，某些拉恩氏菌属菌株具有抑菌性，能够作为植物病害生防菌[14]。芽孢杆菌属在自然界分布非常广，生理特性丰富多样，是土壤和植物微生态优势种群之一。其中，地衣芽孢杆菌是芽孢杆菌中较具有应用潜力的菌种之一，在医药、饲料加工、农药等行业取得了较多的研究成果[15，16]。这2株菌株在板栗果实中的具体作用还有待进一步研究。

　　参考文献：

　　[1] 汪永文，张良富，王 力，等.板栗贮藏保鲜问题及解决措施[J].经济林研究，2009，27（3）：108-114.

　　[2] 贺 伟.板栗实腐病潜伏侵染和发病机理的研究[J].林业科学，2004，40（2）：96-102.

 

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